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选对凝胶很重要

3种最常见的凝【níng】胶【jiāo】包【bāo】括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate. Tris-Glycine凝胶的PH为8.6，且保质期很短。在跑胶【jiāo】的过程中，PH还有上升的趋势，可【kě】达到9.5。这会导致【zhì】蛋白【bái】降解【jiě】和低分辨【biàn】率。

Bis-Tris凝胶的PH为6.4，相对Tris-Glycine凝胶，稳定性和保质期都有所增【zēng】加。但这种【zhǒng】凝胶【jiāo】需要在【zài】溶液中增加抗氧化剂，比如DTT，以维持蛋【dàn】白的还【hái】原性。

Tris-Acetate 凝胶【jiāo】的PH为7，跑大分子蛋白【bái】会呈现很【hěn】高的【de】分辨率。跑大分子蛋白时【shí】，我们推荐使【shǐ】用【yòng】Tris-Acetate 凝胶。

凝胶浓度很重要

既然选【xuǎn】择了Tris-Acetate 凝【níng】胶，还【hái】有几个要【yào】考虑的【de】问题。凝胶浓度【dù】与孔径【jìng】成反比【bǐ】：浓度【dù】越小，孔径越大。较大的蛋白质【zhì】更容易【yì】通过较大的【de】孔，所以我建议使用低百分比的凝胶，如7％。可以使【shǐ】用梯度凝胶或非梯度凝胶，梯【tī】度凝胶非【fēi】常【cháng】适合新样本。

提高转移buffer中的SDS，减少甲醇

转移buffer的组成至关重要【yào】。如果有【yǒu】甲醇存在，大分子【zǐ】蛋白很【hěn】容易沉【chén】淀。通过减少【shǎo】转移【yí】buffer中的甲醇百分比【bǐ】（10％或更低）来【lái】避免【miǎn】这种情【qíng】况发生【shēng】。为了进一步【bù】确保蛋白质【zhì】不会沉【chén】淀，考虑添加SDS至终浓度为0.1％。SDS向蛋白添加均【jun1】匀的负电荷，使得它们更容易从凝胶转移到膜上。

选择合适的膜

膜一般有PVDF膜或NC膜。跑大分【fèn】子【zǐ】蛋白选【xuǎn】择PVDF膜。如前面所说，如【rú】果有【yǒu】甲醇存在，大分子蛋【dàn】白很容【róng】易沉【chén】淀。而PVDF膜不需要在转移buffer中【zhōng】添加甲醇，目的蛋白转【zhuǎn】印的机会更【gèng】高。两种类型【xíng】的膜都【dōu】有各种孔径尺寸，最常见的是0.2um和0.45um。与凝【níng】胶一样，较大的【de】蛋【dàn】白比【bǐ】较【jiào】小【xiǎo】的更容易【yì】穿过大孔隙。大多数【shù】蛋白质（> 20kDa）可【kě】以用0.45um膜转【zhuǎn】移，避免使用0.2um孔径。

增加转印时间

在【zài】正确【què】地选择完凝胶、转印【yìn】膜【mó】及转移buffer后，转【zhuǎn】印正式开【kāi】始。半【bàn】干转快且方【fāng】便，但不适【shì】用于大分子【zǐ】蛋【dàn】白。我建议湿转，因为大【dà】分子蛋白转移时间很慢，推荐350-400 mA转移【yí】90min或 4°C，40 mA，转【zhuǎn】印过【guò】夜。

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